设为首页
本文章记录了我们如何使用SpectraMax多功能酶标仪执行稳定，免洗细胞因子实验，并具有良好的Z因子。
HTRF是由Cisbio试剂公司研发的多功能技术，用于检测生物分子间相互作用。它结合了荧光共振能量转移（FRET）技术和时间分辨荧光（TRF）技术，实现消除半衰期短的背景荧光。这个实验应用供体和受体荧光染料。当供体和受体之间足够近的情况下，由光源（如，高能闪烁氙灯）照射产生的供体激发光就会通过能量转移机制到受体，反过来作为受体的特定激发波长。HTRF采用四个特定的荧光染料，可以组合成兼容的供体-受体TR-FRET对。供体为铕元素（Eu3+）和铽元素（lumi4™- Tb），其长寿命荧光使它们可以应用在时间分辨荧光实验中。两种受体已经被研发用于HTRF实验，分别是, XL665 and d2。都具有激发光谱重叠的HTRF供体的发射光谱。每个都在665nm有一个发射峰，但这个区域的波长并不能激发供体，或者激发非常弱。最早期的的HTRF受体，XL665，来源于红藻的藻胆蛋白色素的纯化。第二代受体，d2，是一种改进的别藻蓝蛋白，比XL665小100倍，用来缓解可能发生在XL665检测时的空间位阻问题。
类似于肿瘤坏死因子（TNFα）的细胞因子在肿瘤、感染性疾病、过敏和自身免疫性疾病等领域都有特别的兴趣。细胞因子的调节紊乱会引起不适当或无效的免疫反应。人肿瘤坏死因子检测试剂盒能够直接进行TNFα的定量。涉及两个特异性抗体的三明治免疫试验，一个抗TNFα偶联Eu元素，第二个抗TNFα标记XL665or d2。TNFα存在的情况下，两个抗体都会结合TNFα，当两个标记足够近的情况下就会发生TR-FRET（见图1）。信号与样品中抗原的浓度成正比。
一、材料
人肿瘤坏死因子检测试剂盒，1000 test（Cisbio P/N 62TNFPEB）
黑色和白色低体积384孔微孔板（Greiner P/N 784076 and 784075）
SpectraMax Paradigm多功能酶标仪（Molecular Devices）
HTRF检测试剂盒（Molecular Devices P/N 0200-7011）
二、方法
人肿瘤坏死因子标准品浓度范围从20到2000 pg/ml，制备方法如试剂盒内的产品说明书所示。内含人肿瘤坏死因子的阳性质控和没有人肿瘤坏死因子的阴性质控（没有TR-FRET），包括确认检测活性并有助于准确的计算结果。试剂最后每孔的体积为20ul，上表所示。微孔板贴膜室温孵育三小时，然后在SpectraMax Paradigm 酶标仪的HTRF卡盒上检测时间分辨荧光
三、数据分析
HTRF试剂的分析方法采用Cisbio公司的专利比例还原法，是基于两种激发波长检测。供体在616nm的发射作为内参，而在665nm的受体的发射被用来作为一个生物反应的指标被检测。这种比例检测方法减少了孔间干扰并消除了复合物的干扰。在下面第四步计算的Delta F值，反映了信号的实验背景，对内部试剂间比较很有用。
结果通过665nm/616nm比值进行计算并用Delta F值表示：
1. Ratio = (Emission665nm/Emission616nm) x 104
2. Mean Ratio =Σratios/2
3. CV = (Std deviation/Mean ratio) x 100
4. Delta F = (Standard or sample Ratio–Rationeg / Rationeg) x 100
(Rationeg = Ratio of negative control)
Z’ factor值由阴性对照和2000pg/ml的标准品计算得到。数据获取和分析都是由SoftMax® Pro完成，软件内置多种优化好的HTRF模板来简化检测和分析。
HTRF Human TNFá 计算曲线由 SpectraMax Paradigm酶标仪产生. 蓝色：
黑板；红色：白板。R2值都为1.00.
四、结果与结论
SpectraMax Paradigm酶标仪具有读板高度和板的优化功能，让用户可以轻松确定最佳的阅读高度和板尺寸，提高检测的动态范围和灵敏度。两种优化都是针对一个Greiner板进行。数据表示为Delta F %（DF %）和TNFα浓度作图（图2）。每次检测采用30个脉冲以得到最好的结果，延迟0.03毫秒和检测时间为0.2毫秒（表2）
SpectraMax Paradigm酶标仪配置HTRF检测卡盒实现高通量筛选的同时，保证优化的读板时间和Z’ factor值。双通道发射同时检测也使得384孔板全板的读板时间只有2/17。在SpectraMax Paradigm酶标仪上获得的高Z’ factor显示出好的灵明度和动态范围。这种方法也可以在SpectraMax®i3和SpectraMax®M5e多功能酶标仪上检测、数据采集和分析。
更多详情请关注Molecular Devices美谷分子仪器官网
推荐阅读：华人时尚
